Verificación de un método alternativo de detección y cuantificación de Legionella spp. en un laboratorio de salud pública: separación inmunomagnética (SIM) e identificación mediante reacción colorimétrica

Eva Álvarez Merchán, Juan Manuel Fernández Gallego, Juan Carlos Montero Rubio

Resumen


El Real Decreto 865/2003 para la prevención y control de la legionelosis menciona el método de cultivo de la norma ISO 11731 para el ensayo de Legionella spp., norma en torno a la cual, se definen límites paramétricos. Las debilidades observadas en esta ISO (falsos negativos y elevados tiempos de espera), han hecho necesario buscar métodos alternativos. Se estudia si el método de separación inmunomagnética y cuantificación por colorimetría de Legionella spp., Legipid ® Legionella Fast Detection, (SIM), es adecuado y eficiente en un laboratorio oficial de Salud Pública para muestras ambientales de agua. En ausencia de una metodología normalizada para verificar métodos alternativos, se ha diseñado un método para realizar esta verificación, teniendo en cuenta los criterios específicos para análisis microbiológicos y la guía para kits de ensayo de ENAC. Así, se han calculado los parámetros de precisión y recuperación en las muestras inoculadas y, además, la linealidad a partir de la pendiente y la ordenada en el origen de la relación entre absorbancia y unidades formadoras de colonias, comparando los datos experimentales obtenidos con los resultados de la validación del método. Los resultados fueron satisfactorios en todos los casos. Una dispersión inferior al 20 %, una recuperación del 4 - 71 % y una linealidad conforme con la validación a un nivel de significación superior al 95 %. En base a estos resultados se considera que el método SIM es un método válido para la detección y cuantificación de Legionella spp. en un laboratorio oficial de salud pública.

Palabras clave


Legionella spp.; verificación; separación inmunomagnética; cuantificación; precisión; recuperación; linealidad

Texto completo:

PDF
PDF

Referencias


Organización Mundial de la Salud (OMS). Legionelosis. [actualizado en 2018; citado el 02 de marzo de 2020] Disponible en: https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/ legionellosis.

European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Legionnaires’ disease. En: ECDC. Annual epidemiological report for 2017. Stockholm: ECDC; 2019.

Yackley JK, Sweat D, Fill MMA, Garman K, Dunn JR. Notes from the field: Legionellosis outbreak associated with a hotel aquatics facility - Tennessee, 2017. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2018; 67(2):77-8.

CDC. Legionella: surveillance and reporting. Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, CDC; 2017.

Beer KD, Gargano JW, Roberts VA, Reses HE, Hill VR, Garrison LE, et al. Outbreaks associated with environmental and undetermined water exposures-United States, 2011-2012. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2015; 64:849-51.

Rasch J, Krüger S, Fontvieille D, Ünal CM, Michel R, Labrosse A, et al. Legionella-protozoa-nematode interactions in aquatic biofilms and influence of Mip on Caenorhabditis elegans colonization. Int J Med Microbiol 2016; 306(6):443-51.

Rowbotham TJ. Current views on the relationships between amoebae, legionellae and man. Isr. J. Med. Sci. 1986; 22(9):678-89.

Lau HY, Ashbolt NJ. The role of biofilms and protozoa in Legionella pathogenesis: Implications for drinking water. J Appl Microbiol. 2009; 107(2):368–78.

Berk SG, Ting RS, Turner GW, Ashburn RJ. Production of respirable vesicles containing live Legionella pneumophila cells by two Acanthamoeba spp. Appl Environ Microbiol. 1998; 64(1):279-86.

McCoy WF, Downes EL, Leonidas LF, Cain MF, Sherman DL, Chen K, et al. Inaccuracy in Legionella tests of building water systems due to sample holding time. Water Res. 2012; 46(11):3497-506.

Yu VL. Legionella pneumophila (Legionnaires ́ disease). En: Principles and Practice of Infetious Disease 1990; 1764–74.

Prats Pastor G, Domínguez García A. Legionella: el microorganismo. Medicina clínica 2002; 119(2):9-13.

Gião MS, Azevedo NF, Wilks SA, Vieira MJ, Keevil CW. Interaction of legionella pneumophila and helicobacter pylori with bacterial species isolated from drinking water biofilms. BMC Microbiology. 2011; 11:57.

Buse HY, Donohue MJ, Ashbolt NJ. Hartmannella vermiformis inhibition of Legionella pneumophila cultivability. Microb Ecol. 2013; 66(3):715-26.

Real Decreto 865/2003, de 4 de julio, por el que se establecen los criterios higiénico-sanitarios para la prevención y control de la legionelosis. BOE no 171, de 18 de julio.

International Standards Organization: International standard ISO/IEC 17025. General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (International Organization for Standardization); 2017.

International Standards Organization: International standard ISO 16140-1. Microbiology of the food chain. Method validation. Part 1: Vocabulary. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (International Organization for Standardization); 2016.

International Standards Organization: International standard ISO 16140-2. Microbiology of the food chain. Method validation. Part 2: Protocol for the validation of alternative (proprietary) methods against a reference method. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (International Organization for Standardization); 2016.

International Standards Organization: International standard ISO 16140-3.Microbiologyofthefoodchain.Methodvalidation.Part3: Protocol for the verification of validated reference methods and validated alternative methods in a single laboratory. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (International Organization for Standardization); under development.

Entidad Nacional de Acreditación (ENAC): CEA-ENAC-20 Rev. 1: Criterios específicos de Acreditación. Análisis microbiológico. Madrid, España: Entidad Nacional de Acreditación; 2017.

Entidad Nacional de Acreditación (ENAC): G-ENAC-20 Rev. 1: Guía para la selección y utilización de kits de ensayo por los laboratorios. Madrid, España: Entidad Nacional de Acreditación; 2017.

Rodríguez Albalat G, Bedrina Broch B, Jiménez Bono M. Validation of the Legipid® Bioalarm Legionella assay. J AOAC Int. 2012; 95(5):1440–51.

Rodríguez Albalat G, Bedrina Broch B, Jiménez Bono M. Method modification of the Legipid® Legionella fast detection test kit. J AOAC Int. 2014; 97(5):1403-9.

Cruz C, Laso J. Precisión de los métodos cuantitativos en microbiología. Comparativa de distintas sistemáticas de cálculo. Vi Iberolab Precisión. 2010; (1):1-4.

International Standards Organization: International standard ISO 11731. Water quality- Enumeration of Legionella. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (International Organization for Standardization); 2017.

Lee TC, Vickers RM, Yu VL, Wagener MM. Growth of 28 Legionella species on selective culture media: a comparative study. J Clin Microbiol. 1993; 31(10):2764-8.

García MT, Jones S, Peláz C, Millar RD, Abu Kwaik Y. Acanthamoeba polyphaga resuscitates viable non-culturable Legionella pneumophila after disinfection. Environ Microbiol. 2007; 9(5):1267–77.

Asociación Española de Normalización. UNE-EN ISO 10272-2. Microbiología de la cadena alimentaria - Método horizontal para la detección y enumeración de Campylobacter spp. Parte 2: Técnica de recuento de colonias. Madrid, España: (AENOR); 2018.

Asociación Española de Normalización. UNE-EN ISO 11290-2. Microbiología de la cadena alimentaria - Método horizontal para la detección y el recuento de Listeria monocytogenes y Listeria spp. Parte 2: Método de recuento. Madrid, España: (AENOR); 2018.

International Standards Organization: International standard ISO 9308-3. Water quality - Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria - Part 3: Miniaturized method (Most Probable Number) for the detection and enumeration of E. coli in surface and wastewater. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (International Organization for Standardization); 1998.

International Standards Organization: International standard ISO 7899-1. Water quality - Detection and enumeration of intestinal enterococci - Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and wastewater. Geneva, Switzerland: International Standards Organization (International Organization for Standardization); 1998.

Robertson P, Abdelhady H, Garduño RA. The many forms of a pleomorphic bacterial pathogen-the developmental network of Legionella pneumophila. Front Microbiol. 2014; 5:670.

Oliva G, Sahr T, Buchrieser C. The life cycle of L. pneumophila: Cellular differentiation is linked to virulence and metabolism. Front Cell Infect Microbiol. 2018; 8:3.

Ausina V, Catalán V, Cercenado E, Peláz-Antolín C. Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica: Diagnóstico microbiológico y control de la legionelosis. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología. 2005.

Molofsky AB, Swanson MS. Differentiate to thrive: Lessons from the Legionella pneumophila life cycle. Mol Microbiol. 2004; 53(1):29-40.

Piao Z, Sze CC, Barysheva O, Iida KI, Yoshida SI. Temperature- regulated formation of mycelial mat-like biofilms by Legionella pneumophila. Appl Environ Microbiol. 2006; 72(2):1613-22.

Garduño RA, Garduño E, Hiltz M, Hoffman PS. Intracellular growth of Legionella pneumophila gives rise to a differentiated form dissimilar to stationary-phase forms. Infect Immun. 2002; 70(11):6273-83.

Faulkner G, Garduño RA. Ultrastructural Analysis of Differentiation in Legionella pneumophila. Microbial Cell Biology. 2002; 184(24):7025-41.

Al-Bana BH, Haddad MT, and Garduño RA. Stationary phase- and mature infectious-forms of Legionella pneumophila produce distinct viable but non-culturable cells. Environ Microbiol. 2014; 16(2):382-95.

Fonseca M V, Swanson MS. Nutrient salvaging and metabolism by the intracellular pathogen Legionella pneumophila. Front Cell Infect Microbiol. 2014; 4:12.

Kirschner, AKT. Determination of viable legionellae in engineered water systems: Do we find what we are looking for? Water Res. 2016; 93:276-88.

Rodgers FG. Ultrastructure of Legionella pneumophila. J Clin Pathol. 1979; 32(12):1195-202.

Fields BS, Benson RF, Besser RE. Legionella and Legionnaires’ disease: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev. 2002; 15(3): 506-26.

Ducret A, Chabalier M, Dukan S. Characterization and resuscitation of “non-culturable” cells of Legionella pneumophila. BMC Microbiol. 2014; 14:3.

Camaró-Sala ML, Martínez-García R, Olmos-Martínez P, Catalá- Cuenca V, Ocete-Mochón MD, Gimeno-Cardon, C. Validación y verificación analítica de los métodos microbiológicos. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2015; 33(7):31-6.

Díaz-Flores A, Montero JC, Castro FJ, Alejandres EM, Bayón C, Solís I, et al. Comparing methods of determining Legionella spp. in complex water matrices. BMC Microbiol. 2015; 15:91.

Bedrina B, Macián S, Solís I, Fernández-Lafuente R, Baldrich E, Rodríguez G. Fast inmunosensing technique to detect Legionella pneumophila in different natural and anthropogenic environments: comparative and collaborative trials. BMC Microbiol. 2013; 13:88.

Dietersdorfer E, Kirschner A, Schrammel B, Ohradanova-Repic A, Stockinger H, Sommer R, et al. Starved but non-culturable (VBNC) Legionella strains can infect and replicate in amoebae and human macrophages. Water Res. 2018; 141:428-38.

Cebrián F, Montero JC, Fernández PJ. New approach to enviromental investigation of an explosive Legionnaires’ disease outbreak in Spain: early identificacion of potential risk sources by rapid Legionella spp. inmunosensing technique. BMC Infect Dis. 2018; 18(1):696.

Epalle T, Girardot F, Allegra S, Maurice-Blanc C, Garraud O, Riffard S. Viable but not culturable forms of Legionella pneumophila generated after Heat Shock Treatment are infectious for macrophage-like and alveolar epithelial cells after resuscitation on Acanthamoeba polyphaga. Microb Ecol. 2015; 69(1):215-24.

Oliver JD. Recent findings on the viable but non-culturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiol Rev. 2010; 34(4):415-25.

Whiley H, Taylor M. Legionella detection by culture and qPCR: Comparing apples and oranges. Crit Rev Microbiol. 2016; 42(1):65-74.

Entidad Nacional de Acreditación (ENAC): NT-20 Rev. 2: Alcances de acreditación: ensayos de agua. Madrid, España: Entidad Nacional de Acreditación; 2007.

Alleron L, Khemiri A, Koubar M, Lacombe C, Coquet L, Cosette P, et al. VBNC Legionella pneumophila cells are still able to produce virulence proteins. Water Res. 2013; 47(17):6606-17.


Enlaces refback

  • No hay ningún enlace refback.




Copyright (c) 2021 Revista de Salud Ambiental

Licencia de Creative Commons
Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial 4.0 Internacional.